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各组小鼠肝脏中抗氧化指标如图3所示。与正常组相比，菊废D-半乳糖组小鼠肝脏组织中SOD和GPx活力显著降低（P＜0.05），渣提MDA含量显著升高（P＜0.05），取物表明经D-半乳糖诱导，两种小鼠肝脏组织中抗氧化活性显著下降，甜叶脂质过氧化物显著增多。菊废与D-半乳糖组相比，渣提样品1的取物低、中、两种高剂量组小鼠肝脏组织中SOD和GPx活力均显著增加，甜叶MDA含量显著下降，菊废其中高剂量组SOD和GPx活力分别增加了96.51%和122.52%（P＜0.05），渣提MDA含量降低38.2%（P＜0.05）；样品2的取物低、中、高剂量组小鼠肝脏组织中SOD和GPx活力较D-半乳糖组均显著增加，其中高剂量组SOD和GPx活力分别增加了192.06%和189.83%（P＜0.05），样品2的低、中剂量组小鼠肝脏内MDA与D-半乳糖组之间无显著性差异，而高剂量组MDA含量较D-半乳糖组显著降低了34.1%（P＜0.05）。两种甜叶菊废渣提取物之间相比，对D-半乳糖处理小鼠肝脏抗氧化指标（SOD，GPx和MDA）的影响无显著性差异（P＞0.05）。综合以上结果表明，两种甜叶菊废渣提取物均具有提高D-半乳糖诱导衰老小鼠肝脏中抗氧酶活力和清除肝脏中自由基和脂质过氧化物的能力，具有缓解肝脏氧化应激损伤的效果。
甜叶菊废渣提取物对小鼠脑组织中SOD，GPx和MDA的影响结果见图4。与正常组相比，D-半乳糖组小鼠脑组织内SOD和GPx活力显著降低（P＜0.05），MDA含量显著增加（P＜0.05），表明经D-半乳糖诱导，小鼠脑组织内抗氧化酶活性显著下降，脂质过氧化物显著增多，模型构建成功。两种甜叶菊废渣提取物低剂量组小鼠脑组织内SOD和GPx活力，MDA含量与D-半乳糖组相比均无显著性差异（P＞0.05）；两种甜叶菊废渣提取物中剂量组小鼠脑组织内SOD活力较D-半乳糖组分别显著增加了66.87%和62.16%（P＜0.05），GPx活力无显著性差异（P＞0.05），样品1中剂量组小鼠脑组织内MDA含量较D-半乳糖组显著下降了39.10%（P＜0.05），而样品2中剂量组小鼠脑组织内MDA含量与D-半乳糖组之间无显著性差异（P＞0.05）；与D-半乳糖组相比，样品1高剂量组小鼠脑组织内SOD和GPx活力分别显著增加了73.85%和19.56%（P＜0.05），MDA含量与D-半乳糖组之间无显著性差异（P＞0.05），样品2高剂量组小鼠脑组织内SOD和GPx活力较D-半乳糖组分别显著增加了73.48%和24.71%（P＜0.05），MDA含量显著下降了38.46%（P＜0.05）。两种甜叶菊废渣提取物之间相比，对D-半乳糖处理小鼠脑组织抗氧化指标（SOD，GPx和MDA）的影响无显著性差异（P＞0.05）。综合以上结果表明，两种甜叶菊废渣提取物均具有提高D-半乳糖诱导衰老小鼠脑组织中抗氧酶活力和清除脑组织中自由基和脂质过氧化物的能力，有效防止或缓解脑组织中自由基导致的氧化应激损伤，从而起到抗氧化的作用。
综合以上结果可知，两种甜叶菊废渣提取物高剂量组对D-半乳糖诱导的小鼠体内氧化应激损伤抑制作用效果优于低剂量和中剂量组，因此选择高剂量组研究甜叶菊废渣提取物对D-半乳糖处理小鼠脑组织中抗氧化酶相关基因的表达水平。如图5所示，与正常组相比，D-半乳糖处理可显著降低小鼠肝脏组织中GPx1，SOD1，HO-1和Nrf-2基因相对表达水平（P＜0.05）。与D-半乳糖组相比，样品1高剂量组GPx1，SOD1，HO-1和Nrf-2基因相对表达水平分别显著提高了37.55%，68.95%，94.53%和58.74%（P＜0.05）；样品2高剂量组GPx1，SOD1，HO-1和Nrf-2基因相对表达水平分别显著提高了39.79%，60.21%，98.16%和58.01%（P＜0.05）。两种甜叶菊废渣提取物之间相比，对D-半乳糖处理小鼠脑组织抗氧化基因的相对表达（GPx1，SOD1，HO-1和Nrf-2）水平无显著性差异（P＞0.05）。综合以上结果表明，两种甜叶菊废渣提取物高剂量组均能激活D-半乳糖处理小鼠体脑组织内抗氧化基因的表达，增强其体内抗氧化活性。
Barroso等通过HPLC-DAD-ESI/MS对两种贮存条件下的甜叶菊提取物成分进行鉴定，发现其含有18种酚酸和黄酮类化合物，其中含量最高的为绿原酸和异绿原酸A。本研究鉴定的两种甜叶菊废渣提取物中的主要成分为咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、槲皮素和槲皮苷，均包含在Barroso等报道的18种酚酸和黄酮化合物之中，其中含量最高的为咖啡酸、异绿原酸C和异绿原酸B，Barroso等研究的甜叶菊提取物是从甜叶菊叶片中提取得到，而本研究使用的甜叶菊废渣提取物是从甜菊糖苷生产过程中产生的絮凝废渣中提取得到，因此两者主要成分之间存在差异Shukla等和Tadhani等研究表明甜叶菊提取物具有较强的体外抗氧化活性，能抑制一系列自由基，如DPPH、羟自由基、一氧化氮等。另外，有研究显示槲皮素具有较强的抗氧化作用，其体外抗氧化作用与维生素C和维生素E作用相当，同时槲皮素还可以提高二甲基亚砜诱导小鼠体内总抗氧化能力，绿原酸和咖啡酸可以增强脑缺血再灌注损伤模型大鼠体内的抗氧化能力。
本研究鉴定的两种甜叶菊废渣提取物均含有这些已报道的具有抗氧化作用的成分，因此甜叶菊废渣提取物具有提高机体抗氧酶活力，清除自由基和脂质过氧化物的能力，可有效防止或缓解自由基导致的氧化应激损伤。
D-半乳糖诱导衰老模型最早在1985年，由徐敝本在使用啮齿动物衰老模型进行延缓衰老药物的研究中提出。D-半乳糖的作用机制与氧化应激损伤，钙稳态失调，线粒体老化，非酶糖基化反应，端粒短缩及端粒酶的活性下降，以及免疫功能减退有关。D-半乳糖诱导衰老模型与其它衰老模型相比，与自然衰老最为相近，成模简易，结果稳定，因此得到较广泛推广应用。本试验中，小鼠经颈部皮下注射D-半乳糖11周之后，肝脏、脑和血清中SOD和GPx活性均显著降低，MDA含量显著升高，抗氧化酶基因表达量显著下降，这与高璐等和Lei等的结论一致，表明衰老模型构建成功。
酶促反应系统被认为是体内抗氧化系统的第一道防线，具有清除自由基，催化细胞内过氧化物分解等作用，防止氧化应激对机体造成的伤害，对细胞具有保护作用，主要由一些酶组成，如SOD，GPx等，非酶促反应体系主要为维生素、氨基酸和金属蛋白质。本研究结果显示，与D-半乳糖组小鼠相比，两种甜叶菊废渣提取物高剂量组小鼠体内SOD，GPx活性显著增加，MDA含量显著降低，抗氧化酶基因的相对表达量相对增加，这与符莎露等报道植物多酚对衰老小鼠抗氧化作用研究结果一致，表明甜叶菊废渣提取物具有良好的抗氧化、防衰老作用。Nrf-2在抗氧化酶基因的转录中起着重要作用，是细胞氧化应激反应中的关键因子，与抗氧化反应元件结合，启动下游靶基因如HO-1，SOD和GPx等基因的表达，从而提高抗氧化酶的活性。文献报道一些天然化合物，如槲皮素、绿原酸等，可通过激活Nrf-2，增加HO-1等抗氧活性酶的mRNA表达，本试验中的甜叶菊废渣提取物高剂量组富含多酚黄酮类化合物，能提高抗氧化基因GPx1，SOD1，HO-1和Nrf2的表达，研究结果与文献报道一致。Jeong等研究表明，植物多酚类可以通过激活D-半乳糖模型小鼠体内PI3K/Akt/Nrf2信号通路，缓解体内氧化应激损伤，因此甜叶菊废渣提取物对D-半乳糖致衰老小鼠的抗氧化机制可能与激活小鼠体内PI3K/Akt/Nrf2信号通路，提高小鼠体内抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化物质的生成有关，对其抗氧化作用机制进行进一步研究具有重要意义。
两种甜叶菊废渣提取物富含酚酸和黄酮类化合物，能提高衰老模型小鼠血清、肝脏、脑组织SOD和GPx活力，降低MDA含量，增强抗氧化酶基因的相对表达，说明两种甜叶菊废渣提取物均能有效缓解D-半乳糖对小鼠造成的氧化应激损伤。因此，甜叶菊废渣提取物具有良好的体内抗氧化作用，为今后甜叶菊废渣提取物相关产品的开发利用提供了一定的科学依据。
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相关链接：甜叶菊，D-半乳糖，异绿原酸C，异绿原酸B
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